一分子诊断学的定义
分子诊断学从出现之日起,在检验医学领域就一直受到对其“身份”的挑战有人认为分子学诊断只是对一些生物大分子-DNARNA或蛋白质检测方法和技术的汇总,就像我们通常不将标记技术称为标记诊断学,发光技术称为发光诊断学一样,分子诊断学也不应独立成为一门学科;也有人认为“分子诊断学”的概念太过狭义人们习惯于将“诊断学”理解成临床上用来诊断疾病的各种检查程序实际上,分子诊断学更重要的意义还在于对疾病的研究和指导治疗,分子诊断能为临床提供包括诊断在内的各种丰富的信息然而,无论人们怎样看待,对临床实验室来说,分子诊断学出现的意义和价值已不容忽视在不到十年的时间里,基于全基因组信息的分子诊断学技术已经发展成为可以对许多疾病和易患病体质进行检测的强有力工具
在定义分子诊断学时,最值得关注的是其诊断内涵的拓展分子诊断学早已突破了单纯分子生物学理论和技术的范畴,也不再仅局限于对疾病的筛查和诊断当今分子诊断学的发展更有助于阐明疾病发生发展的分子学机制;有助于从分子基础上对疾病的异质类型进行区分鉴别;有助于为疾病进程各阶段提供准确特异的分子诊断指标;有助于疾病的早期筛查殁鉴别诊断;有助于从分子基础上为临床制订治疗方案判断治疗效果;有助于判断某些疾病的易感人群及易感分子学基础;有助于为分子治疗提供有效的靶向及追踪
如果说在分子诊断学问世之前,人们对疾病的诊断仅仅基于对机体各种代谢指标的变化,抗原抗体的水平,病理形态学特征的掌握来进行判断随着分子生物学的迅速发展,对基因组学蛋白组学以及表观遗传学研究的不断深入,人们开始尝试采用基因芯片等技术来分析外源性致病原基因和(或)机体内部基因表达谱的改变;尝试采用质谱仪等技术来分析蛋白与基因的关系,蛋白与蛋白的关系,以及蛋白质谱的变化,通过识别这些分子标记(molecular signature)来对疾病作出分类和诊断
因此,分子诊断学可以理解为是一门将分子生物学分子遗传学原理和技术应用于疾病的实验室诊断学科,其将分子生物的理论和技术与实验室医学有机地结合在了一起分子诊断学的核心是基于核酸和蛋白的诊断技术,通过检测各种机体外源性及内源性生物分子以及分子体系的存在结构或表达调控等改变,为疾病的预测诊断治疗预后及转归提供分子水平上的诊断信息
二分子诊断学的发展简史及主要技术
1949年,Pauling殁其同事发现p一血红蛋白氨基酸序列上一个特定氨基酸的改变导致了镰形红细胞性贫血的发生,由此引入了分子疾病( molecular disease)的概念,此后的研究进一步揭示了这种氨基酸序列的改变源自DNA序列上某个特定碱基的改变,这些发现使人们认识到疾病的发生发展与生物大分子改变之间的密切联系,并意识到可以通过检测某些特定的分子来诊断疾病,这种诊断方式较之前的通过观察病理改变和临床症状进行诊断更为准确,尽管在当时并没有适当的技术手段支持这种想法成为现实,但无疑为分子诊断学的诞生奠定了基础
分子诊断学的发展与分子生物学的发展密不可分,分子生物学为分子诊断学提供了主要的理论基础和技术手段,1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋之后,分子生物学开始作为一门独立学科迅速发展分子诊断学也在此基础上开始出现并渐具规模分子诊断学的发展及其技术进步大致可分为以下三个阶段:基于杂交技术的分子诊断阶段;基于PCR技术的分子诊断阶段;后基因组时代基于生物芯片等技术的高通量分析诊断阶段
1.基于杂交技术的分子诊断技术 20世纪70年代,DNA重组技术迅速发展,cDNA克隆和测序技术使得人们对多种基因的基本序列有了初步认识,为分子诊断学的出现提供了理论基础探针技术Southern印迹等印迹技术为分子诊断学提供了方法和手段,分子诊断学由此进入了第一个技术突破阶段,即基于杂交技术的分子诊断阶段
1976年,Kan及其同事历史上第一次通过杂交技术分析了胎儿的成纤维细胞DNA,实施了a-地中海性贫血的产前诊断1978年Kan和Dozy完成了镰形红细胞性贫血的分子诊断此后,一系列类似遗传性疾病的基因诊断方法相继建立,如1983年Woo等建立的苯丙酮酸尿症的基因诊断方法;1986年,Farrall等建立的对膀胱纤维化的诊断方法,等等
1982年,Orkin等发现经肉切酶消化后,基因组DNA所呈现的不同大小片段与特定的』3一血红蛋白基因突变相偶联,这种限制片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism,RFLP)技术可
用来比较不同个体DNA水平上的差异(即多态性),从而建立起一种针对致病性基因突变的初筛方法
基于杂交技术的基因分析方法主要有:①Southern印迹(Southern blotting);②Northern印迹(Northern blotting);③斑点杂交(dot blotting);④原位杂交(i扎situ hybridization);⑤RFLP分析技术等
基于杂交技术的分子诊断方法在当时主要应用于遗传疾病的基因诊断它是第一种真正意义上的分子检验技术,在分子诊断学的发展中具有开创性的地位
虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史,但它在核酸的结构和功能研究中作出了重要贡献,在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也功不可没但在当时,基于杂交技术的基因诊断技术仍有很多不足例如,致病性突变的确定只能通过建立患者基因组DNA文库的方式来进行,技术复杂,周期长,对样品纯度要求较高,样品用量太,费用高;检测中需采用放射性物质,限制了其广泛应用;RFLP分析多态性的信息含量低,多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量,RFLP多态性图谱的建立较为繁琐等,这些都使得该技术的应用受到了一定的限制
如今,随着核酸探针制备及标记技术的不断丰富和完善,以不同材料为支持物的固相杂交技术(如基因芯片)的应运而生,为核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用开辟了新的天地
2.基于PCR技术的分子诊断技术 Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想,1985年美国PE - Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应,但所用酶为DNA聚合酶I的Klenow片段,精确性差,且不耐热;1988年,Keohanog改用精确性更好T4 DNA聚合酶进行PCR扩增,但此酶仍不耐热;同年Saiki从水生嗜热杆菌(Ther7T/us aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶用于PCR反应,命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA polymerase),此酶的发现使得PCR技术获得了广泛应用
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端豆补的寡核苷酸引物反应由变性退火延伸三个基本反应步骤构成,经多次循环后使得靶序列成指数扩增,数小时内即可将目的基因扩增放大百万倍,甚至千亿倍PCR技术不仅减少甚至取消了放射性物质的使用,而且可以使极微量样本在短时间内得到指数级扩增,这些特点使得分子诊断学得以进入临床检验实验室,用于一些已知基因突变的检查工作,如:某些遗传疾病的产前诊断病原微生物基因的检测等,成为临床上必不可少的常规检查技术
随着PCR技术的广泛应用和发展,根据靶序列扩增后的检测方法,以PCR为基础的核酸检测技术大体可分为三类:
(l)基于酶处理技术的检测方法:RFLP是最早获得广泛应用的变异检测技术,根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的限制性内切酶进行酶切后,即可获得不同大小的片段,这些片段可以通过杂交或电泳进行鉴定,且能应用于靶基因分型及变异性研究
除此之外,还有一些基于DNA序列二级结构的技术,例如T4内切酶Ⅶ和T7内切酶IT7内切酶I可以识别并切割不完全匹配的DNA十字形DNA结构Holliday结构或DNA分叉点等结构,将目的基因的野生型DNA片段变性后与PCR扩增产物进行杂交,如果产物DNA序列含有基因突变,则与对应的野生型DNA片段形成不完全匹配的异源二聚体DNA,从而被T7内切酶工切割,对切割产物进行分析可判断PCR扩增的目的基因序列中是否含有突变及具体的突变位点;
寡核苷酸连接分析是基于连接酶的分析方法该方法设计有两个寡核苷酸片段,与野生型基因互补且头尾相接,如PCR扩增产物序列与野生型序列一致,变性杂交后,两个片段头尾相接,连接酶可将两者连接,形成双链反之,如果PCR产物序列在两段寡核苷酸连接处存在变异,则不能连接
(2)基于电泳技术的检测方法:电泳是PCR产物检测最常用的方法,除可单独使用外,也可与酶切技术联合使用由于DNA片段具有双性电离的特征,在一定的黾泳缓冲液中带有电荷,DNA片段长度的大小会影响电泳的迁移率,从而可以通过电泳加以区分
目前常用的电泳分析技术有:
1)单链构象多态性( singlestrand conformation polymorphism,SSCP)分析:单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象,这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的,当有一个碱基发生改变时,会或多或少地影响其空间构象,使构象发生改变,空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同因此,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),可以非常敏锐地将构象差异的分子分离开
2)杂合双链分析法(heteroduplex analyses,HA):该法与SSCP相似,所不同的是SSCP分离的是单链DNA,HA法分离的是双链DNAHA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型野生型DNA杂化双链由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起,在非变性凝胶中电泳时,会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用,两者结合使用,可使突变检出率提高到近100% 这两种方法存在一些局隈性,例如,只适用于200- 300 bp的片段;只能检测突变存在与否,要最后确定突变的位置和类型,还需进一步测序;对电泳条件要求较严格等此外,由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的,所以当某些位置的点突变对构象不起作用或作用很小时,电泳无法分辨
尽管如此,SSCP和HA仍有较高的检测率,而且简便快速灵敏,不需要特殊的仪器且价格低廉,可以同时检测多种不同的序列变异,适合临床实验的需要,易于自动化,可用于高通量DNA变异的检测对于未知基因的突变,扩增产物可先经SSCP或HA分析,然后进一步提纯,最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段必须强调的是,尽管有着多种DNA变异的检测方法,基因序列测定仍然是变异检测的金标准
3) DGGE和TGGE:变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)最初是
由I_erman等于20世纪80年代初期发明的,起初主要用来检测DNA片段中的点突变Muyzer等在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究后来又发展出其衍生技术——温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis, TGGE).
取链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,其迁移行为决定于其分子大小和电荷不同长度的DNA片段能够被区分开,但同样长度便难以区分DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上,加入了变性剂(尿素和甲酰胺)梯度或是温度梯度的因素,从而能够将同样长度但序列不同的DNA片段,依据其不同的解链区域或解链温度区分开来这两项技术目前广泛应用于微生物种群分析等领域
4)二维电泳技术:在X轴聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上。
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